[궁금기술] 디지털 PCR (digital PCR, dPCR)의 원리: dPCR과 qPCR 차이

 

출처: pixabay

 

안녕하세요?

NV2NGN입니다.

 

이번 포스트에서는 디지털 PCR란 무엇이며, 그 원리, Qiagen의 QIAcuity dPCR의 장점과 단점, qPCR과의 차이점, dPCR의 간략한 수행 단계, 마지막으로 관련 논문을 알아보겠습니다.

 

 

디지털 PCR이란?

디지털 PCR(dPCR)은 샘플에 있는 DNA의 양을 정확하게 측정하기 위해 분자생물학에서 사용되는 기술입니다.

그 중 QIAcuity dPCR 시스템은 매우 민감하고 절대적인 핵산 정량을 제공하는 완전 자동화된 나노플레이트 기반 플랫폼입니다. 이는 샘플을 여러 개별 반응으로 분할하여 각 반응에 0개, 1개 또는 그 이상의 표적 분자가 존재하도록 합니다.

 

 

 

디지털 PCR(dPCR)의 원리

 

디지털 PCR은 DNA, cDNA 또는 RNA를 포함한 핵산 가닥을 직접 정량화하고 클론 증폭하는 데 사용할 수 있는 기존 PCR 방법을 개선한 것입니다. dPCR과 기존 PCR의 주요 차이점은 핵산의 양을 측정하는 방법에 있습니다.

dPCR에서는 주형이 되는 핵산, 프라이머, 프로브, 뉴클레오티드, 효소 및 완충액으로 구성된 PCR 반응이 수천 개의 미세 반응으로 나누어집니다.각 파티션은 효과적으로 표적 핵산 분자를 전혀 포함하지 않거나, 하나 또는 여러 개 포함합니다. dPCR 기기는 미세반응을 개별적으로 증폭합니다. 증폭 과정이 끝나면 형광 프로브를 사용하여 각 파티션에 있는 생성물의 유무를 감지합니다. 주형 핵산에 대한 양성 반응은 형광 신호를 방출하고(켜짐), 표적 핵산이 없는 음성 반응은 어두운 상태로 유지됩니다(꺼짐).

QIAcuity Digital PCR의 장점

1. 절대적 정량이 가능하다: 기존 PCR 방법과 달리 dPCR은 정량화를 위해 표준 곡선에 의존하지 않습니다. 이는 핵산의 절대 정량화를 제공합니다.
2. 정밀도 및 감도가 높다: dPCR은 기존 PCR 방법에 비해 검출 한계가 낮고 정밀도가 높습니다.
3. 정량이 견고하다: dPCR은 강력한 정량화를 보여줍니다. 즉, PCR 억제제에 대한 높은 내성이 있고 PCR 효율 변화에 덜 영향을 받습니다.

 

반면에 단점은 아래와 같습니다.

QIAcuity Digital PCR의 단점

dPCR은 많은 장점을 제공하지만 몇 가지 제한 사항도 있습니다.

1. 복잡성: dPCR은 기존 PCR 방법보다 더 복잡하고 시간이 많이 걸릴 수 있습니다.
2. 비용: QIAcuity를 포함한 dPCR 시스템은 기존 PCR 시스템보다 비쌀 수 있습니다.

 

 

 

dPCR과 qPCR의 차이점

 

dPCR과 qPCR은 모두 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 핵산 검출 및 정량 기능을 제공하지만 몇 가지 차이점이 있습니다.

1. 정밀도: dPCR과 qPCR의 주요 차이점은 정밀도입니다. dPCR은 정확한 바이너리 결과를 제공합니다. 이는 문자 그대로 DNA 분자의 존재 여부를 계산합니다.
2. 정량화: qPCR은 정량적, 상대적 또는 절대적이지만 표준 곡선 또는 참조 샘플이 필요합니다. dPCR은 정량적이며 절대적이며 표준이나 유연한 반응량이 필요하지 않습니다.
3. 증폭 측정 유형: qPCR은 각 주기에서 PCR 증폭을 측정하는 반면, dPCR은 PCR 주기가 끝날 때 측정합니다.
4. 돌연변이율 검출: qPCR은 >1%에서 돌연변이율을 검출하는 반면, dPCR은 ≥ 0.1%(높은 신호 대 잡음비)에서 돌연변이율을 검출합니다. 
5. 견고성: dPCR 반응은 휴믹산(humic acid) 및 헤파린과 같은 억제제가 있는 경우에도 견고하게 유지된다고 합니다.

 

 

QIAcuity 디지털 PCR 수행 방법

QIAcuity dPCR은 대략 세 가지 기본 단계가 포함되는 것으로 알려져 있습니다.

1. 준비 및 로드: 먼저 샘플의 DNA 양과 순도를 측정합니다. QIAcuity PCR Master Mix를 검체, 프라이머, RNase가 없는 물 및 선택적으로 제한 효소와 결합하여 프리플레이트에서 반응 혼합물을 준비합니다.

2. 설정 실행 및 증폭: 플레이트가 로드되면 기기가 바코드를 스캔합니다. 제어 소프트웨어에서 이전에 설정한 기본 실험을 플레이트에 연결하고 프라이밍, 사이클링 및 이미징 프로필을 정의하고 실행을 시작할 수 있습니다.

3. 결과 분석: 실행 후 QIAcuity Software Suite를 사용하여 결과를 분석할 수 있습니다.

 

 

dPCR 참고 논문 

 

J Virol Methods. 2023 Nov:321:114802. 

MPXV  절대 정량화를 위한 나노플레이트 기반 디지털 PCR 분석의 개발 및 검증(Development and validation of a nanoplate-based digital PCR assay for absolute MPXV quantification)

 

다양한 인체 해부학적 부위에 걸친 mpox virus (MPXV)의 정량화는 가장 가능성이 높은 전염 경로에 대한 통찰력을 제공할 수 있으므로 MPXV DNA의 절대적이고 정확한 정량적 값을 공개할 수 있는 방법이 중요합니다. 

 

이 연구에서는 임상 검체에서 MPXV DNA의 검출 및 정량화를 위해 새로운 QIAcuity 디지털 PCR(dPCR) 프로토콜을 최적화하고 144개의 생물학적 검체에서 얻은 결과와 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 얻은 결과를 비교하여 분석의 성능을 평가했습니다.

 

전반적으로 두 분석법 간의 일치성은 95%였으며, 샘플은 MPXV DNA 양성으로 동일하게 식별하었으며, μl당 평균 복사본 수는 1708(95% CI: 107-2830 복사본/μl)이었습니다. 나머지 샘플에서는 7개 중 5개가 QIAcuity dPCR 분석에서는 검출되었지만 qPCR에서는 검출되지 않아 일치하지 않는 결과가 나왔습니다. QIAcuity dPCR로 측정한 MPXV DNA 수준은 qPCR로 검출한 Ct 값 및 이전에 개발한 다른 dPCR 분석으로 검출한 값과 강한 상관관계가 있었습니다.

 

이번 연구에서  QIAcuity dPCR 분석은 다양한 생물학적 시료에서 MPXV DNA 정량화를 위한 강력하고 수행하기 쉬운 방법이 될 수 있음을 시사합니다.

 

이 논문에서 제시한 결과 중 일부를 잠깐 살펴볼까요?

 

그림 2. QIAcuity dPCR과 Biorad ddPCR 간의 MPXV DNA 측정값의 상관관계 (출처 J Virol Methods. 2023 Nov:321:114802)

 

Biorad사의 ddPCR과 Qiagen QIAcuity dPCR의  MPXV DNA 측정값의 상관 관계를 살펴 볼 때, 상관 계수 r = 0.984 (p < 0.0001) 인 것으로 나타났습니다.

 

 

 

 QIAcuity dPCR 관련 링크는 아래와 같습니다.

 

 

신우엘에스

 

 

 

Nanoplate dPCR products | QIAcuity - Digital PCR System | QIAGEN

 

관련 도서 링크입니다.

 

- 프라이머 디자인(primer design)  https://www.aladin.co.kr/shop/wproduct.aspx?ItemId=355765770&start=slayer

[전자책] 바이오에피소드 시리즈 프라이머 디자인(primer design) : 알라딘

 

- ddCt 계산하기 

[전자책] 바이오에피소드 : ddCt 계산하기 : 알라딘

 

- Realtime PCR FAQ 

[전자책] Realtime PCR FAQ : 알라딘

 

 

이번 포스트에서는 digital PCR에 대해 알아보았습니다.

 

지금까지 NV2NGN이었습니다.

 

감사합니다.

 

 

 

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