[궁금사전] 웨스턴블랏: 베타멀캅토 에탄올 (Western blot: β-mercaptoethanol)

출처: pixabay

 

 

 

[과학체험] 현미경 체험 캠프

 

드디어 Y가 배양한 세포를 배양기에서 꺼냈다

 

바로 웨스턴 블랏을 하는 날이다.

며칠 동안 약물을 세포에 처리하고, 세포 모양을 추적 관찰한 끝에, 드디어 회수할 날이 오늘인 것이다.

Y가 주목하고 있는 단백질 PXX 가 약물에 영향을 받는지 확인하기 위해서다.

세포를 PBS로 씻어 주고, 회수하여 용해액에 넣어 일련의 지루한 단계를 거쳐 단백질을 분리했다.

다시 단백질 농도를 측정하고, 적절한 양의 단백질을 취하여 샘플 버퍼와 함께 섞어 주었다.

 

"으윽, 냄새!"  절로 얼굴이 찡그려졌다.

화합물용 후드에서 사용해도, 연구실로 스물스물 피어나는 냄새는 어쩌지 못했다.

물론 코로나 시대라 실내에서도 K94 마스크를 썼지만, 지독한 냄새를 막기엔 역부족이다.

 

'에고, 언제까지 이 냄새를 맡아야 하나?'

 

바로 샘플 버퍼 속 베타 멀캅토에탄올 때문이었다.

 

 

베타 멀캅토에탄올, 이황화 결합을 감소시키는 데 사용되는 불쾌한 냄새의 화합물이다

 

베타 멀캅토에탄올 또는 2-멀캅토에탄올(줄여서 2-ME로 부르자)은 화학식 C2H6OS의 화합물이다.

일반적으로 이황화 결합 (disulfide bond)을 감소시키는 데 사용되며, 히드록실 라디칼을 제거함으로써 생물학적 항산화제로 작용한다. 냄새는 불쾌하지만 관련 티올보다 덜 불쾌하다고 한다.

2-ME은 일부 단백질에 존재하는 시스테인 잔기의 이황화 결합을 끊어  변성시킬 수 있다.
S-S 결합을 끊음으로써 일부 단백질의 3차 구조와 4차 구조가 모두 파괴될 수 있다.

이처럼 단백질 구조를 파괴하는 능력 때문에 웨스턴 블랏과 같은 단백질 분석에 사용되된다.

그러나 2-ME는 유리 시스테인과 부가물을 형성하고 독성이 다소 있기 때문에 디티오트레이톨(dithiothreitol, 일명 DTT)이 일반적으로 SDS-PAGE에서 더 많이 사용된다고 한다.

그럼에도 불구하고, Y 연구실에서는 2-ME를 웨스턴 블랏을 위해 SDS-PAGE에 자주 사용하고 있다.

 

그러나, 2-ME는 DTT보다  더 안정적이다

왜냐하면, 2-ME는 DTT보다 휘발성이 높고 냄새가 불쾌하지만 DTT보다 더 안정적이기 때문이다.

예를 들어, 2-ME의 반감기는 pH 6.5에서 100시간 이상이고, pH 8.5에서 4시간 정도인데 반해,  

DTT의 반감기는 pH 6.5에서 40시간, pH 8.5에서 1.5시간으로 매우 짧다고 한다.

 

 

단백질 활성을 유지하기 위한 효소 반응에 종종 사용한다

2-ME 및 관련 환원제(예: DTT)는 유리 설프히드릴 잔기의 산화를 억제하여 단백질 활성을 유지하기 위한 효소 반응에 종종 사용된다.  특히 DTT의 경우, 효소 분석에서 표준 완충액 성분으로 자주 사용된다.

 

 

 

세포 용해시킬 때 방출되는 리보뉴클레아제를 제거하기 위해 RNA 분리 과정에 사용한다

 

또한 세포 용해 동안 방출되는 리보뉴클레아제(ribonuclease)를 변성시키기 위해 일부 RNA 분리 과정에 2-ME를 사용한다.

리보뉴클레아제에는 수 많은 이황화 결합이 존재하며, 이로 인해 매우 안정적인 효소로 알려져 있다.

때문에 2-ME를 사용하여 이황화 결합을 줄이고 단백질을 비가역적으로 변성시켜

추출 과정동안 리보뉴클레아제가 RNA를 분해시키는 것을 방지하는 것이다.

 

2-ME는 독성이 있다

냄새가 고약한 것에 더해 2-ME는 독성이 있다.

흡입 시 비강 및 기도에 자극을 유발하며, 피부 자극, 구토 및 섭취를 통한 복통을 유발하고

과도하게 노출될 경우  사망에 이를 수도 있다고 한다. 그러니 반드시 화학용 후드에서 사용하길 권한다.

 

 

Y가 만약 SDS-PAGE에서 2ME를 샘플 버퍼에 넣고 가열하지 않으면?

 

Y가 깜빡하고 만약 SDS-PAGE에서 2ME를 샘플 버퍼에 넣고 가열하지 않을 경우, 어떻게 될까?

이 전기영동에서 단백질 크기에 따른 분해능 (흔히 말하는 단백질 해상도)에 영향을 줄까


샘플 버퍼 속에 포함된 SDS는 균일한 음전하를 부여하고 단백질을 선형화하며,

2ME는 앞서 설명했듯이 시스테인-시스테인 사이의 이황화 결합을 끊는다.

SDS와 2ME를 첨가하고 단백질을 가열하면 단백질을 변성시키는 데 도움이 된다.

가열은 이러한 분해 과정을 가속화하기 때문이라고 하는데, 어느 정도 가열할지는 실험을 통해 최적화 하는 게 좋다.

일부 단백질은 가열하지 않아도 잘 작용하지만, 어떤 단백질은 가열 시간이 오래 필요하기 때문이다.

 

또한 어떻게 단백질을 얻었느냐가 중요하다.

예를 들어 세포 펠렛을 그대로 사용하는 경우 가열하지 않는다면 지저분한 얼룩이 생기는 반면,

정제된 단백질의 경우에는 단백질 크기 분해능이 더 좋을 것이라고 한다.

 

따라서 SDS 및 2-ME를 포함하여 적절한 시간 (대개 5분-10분) 동안 가열한 단백질의 경우와

가열하지 않은 샘플의 경우를 비교하여 직접 확인하고 최적화 하는 과정이 필요할 것이다.

참조: 위키피디아

 

 

 

 

 

 

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Finally, the cells cultured by Y were taken out of the incubator

It's a western blot day.
After several days of treating the cells with drugs and tracking the shape of the cells, 

today is the day to finally harvest them.
This is to determine whether the protein PXX, which Y is paying attention to, is affected by the drug.
Cells were washed with PBS, harvested and placed in a lysate to separate proteins through a series of tedious steps.
The protein concentration was measured again, and an appropriate amount of protein was taken and mixed with the sample buffer.

"Ugh, the smell!"  Y's face was frowned upon.
Even when used in the compound hood, the odor that was wafting out of the laboratory was negligible.
Of course, in the Corona era, Y used a K94 mask indoors, but it was not enough to prevent the terrible smell.

'Damn, how long do I have to smell this?'

It was because of beta-mercaptoethanol in the sample buffer.

Beta-mercaptoethanol, an unpleasant odor compound used to reduce disulfide bonds

Beta-mercaptoethanol or 2-mercaptoethanol (abbreviated as 2-ME) is a compound of the formula C2H6OS.
It is commonly used to reduce disulfide bonds and acts as a biological antioxidant by scavenging hydroxyl radicals. 

Although the odor is unpleasant, it is said to be less unpleasant than the related thiols. 

2-ME can denature cysteine ​​residues by breaking the disulfide bond present in some proteins. 

By breaking the S-S bond, both the tertiary and quaternary structures of some proteins  can be altered and destroyed
Because of this ability to disrupt protein structure, it is used for protein analysis such as Western blot.
However, since 2-ME forms an adduct with free cysteine ​and is somewhat toxic,

dithiothreitol (aka DTT) is generally more used in SDS-PAGE.
Nevertheless, Y lab frequently uses 2-ME for SDS-PAGE for Western blots.

 

Ironically, 2-ME is more stable than DTT

This is because 2-ME is more volatile than DTT and has an unpleasant odor, but is more stable than DTT.
For example, the half-life of 2-ME is greater than 100 hours at pH 6.5 and about 4 hours at pH 8.5.
The half-life of DTT is said to be very short: 40 hours at pH 6.5 and 1.5 hours at pH 8.5.

 

Often used in enzymatic reactions to maintain protein activity

2-E and related reducing agents (eg DTT) are often used in enzymatic reactions to maintain protein activity by inhibiting oxidation of free sulfhydryl residues. Especially for DTT, it is frequently used as a standard buffer component in enzymatic assays.

2-ME used in RNA isolation to remove ribonucleases released during cell lysis

We also use 2-ME in some RNA isolation procedures to denaturate ribonuclease that is released during cell lysis.
Ribonucleases have numerous disulfide bonds, which makes them known to be very stable enzymes.
Therefore, 2-ME is used to reduce disulfide bonds and irreversibly denaturate proteins.
This is to prevent ribonucleases from breaking down RNA during the extraction process.

 

2-ME is toxic

In addition to the foul odor, 2-ME is toxic.
Inhalation causes irritation of the nasal passages and airways, skin irritation, vomiting, and abdominal pain through ingestion. Excessive exposure can lead to death. Therefore, it is recommended to use it in a chemical hood.

 

If 2ME is added to the sample buffer in SDS-PAGE and not heated?

If 2ME is added to the sample buffer in SDS-PAGE and not heated, what will happen?
Does the electrophoresis affect the resolution (commonly called protein resolution) according to the protein size? 

SDS contained in the sample buffer imparts a uniform negative charge and linearizes the protein,
2ME breaks the cysteine-cysteine ​​disulfide bond as previously described.
Adding SDS and 2ME and heating the protein will help denature the protein.
It is said that heating accelerates this decomposition process, 

and it is better to optimize the amount of heating through experimentation.
This is because some proteins work well without heating, while others require a long heating time.

Also, how the protein was obtained is important.
For example, if the cell pellet is used as is, it will cause a messy stain if not heated, 

whereas in the case of purified proteins, the protein size resolution would be better.

Thus, for proteins that have been heated for an appropriate amount of time (usually 5-10 minutes), including SDS and 2-ME and It will be necessary to directly verify and optimize the case by comparing the case of the unheated sample.

 

 

Reference: Wikipedia

https://en.wikipedia.org/wiki/2-Mercaptoethanol